Biji durian (Durio zibethinus) merupakan substrat yang cenderung bersifat sebagai limbah yang minim nilai manfaat. Pembuatan tempe dengan bahan baku biji Durian menjadi solusi alternatif dan merupakan suatu inovasi bahan baku dalam pembuatan tempe dan peningkatan nilai guna biji Durian. Jumlah inokulum dan lama waktu fermentasi yang tepat dalam menghasilkan kualitas tempe berbahan baku biji Durian masih belum diketahui menjadi temuan yang diharapkan dalam penelitian. Rancangan penelitian disusun dengan desain Rancangan Acak Kelompok dengan kadar ragi 0,15 gram : 0,2 gram dengan waktu fermentasi 0 jam, 24 jam, 48 jam, 72 jam, dan 96 jam. Data yang diukur meliputi kadar protein, lemak, dan asam fitat, yang dilanjutkan dengan uji tingkat kesukaan dengan 15 orang panelis dan di ketahui hasil dari uji tersebut bahwa tempe biji durian cukup layak untuk dikonsumsi, karena rasa dan tekstur dari tempe biji durian tersebut memiliki kesamaan dari tempe pada umumnya yang dibuat menggunakan biji kedelai . Data yang diperoleh dianalisis dengan analisis deskriptif, sedangkan data organoleptik dianalisis dengan skala Likert. Hasil penelitian bahwa biji Durian sebelum fermentasi mengalami penurunan kadar protein, dan lemak setelah fermentasi 24jam, sedangkan asam fitat setelah fermentasi 92jam untuk penambahan inokulum 0.15%. Hasil uji sensori menunjukkan 93.33% panelis menilai penambahan ragi 0,15 gram lebih baik dibandingkan ragi 0,2gram berdasarkan warna, rasa, aroma, dan tekstur tempe.